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蛾 美国鳕鱼蛾 CpGV 抗性的第一个证据
抽象 鳕蛾（Cydia pomonella L.）是包括美国在内的全球苹果，梨和核桃果园中非常重要的害虫。Cydia pomonella granulovirus（CpGV）用于控制有机和常规生产中的鳕鱼蛾。由于美国华盛顿州有机苹果园的鳕鱼蛾侵扰增加，对五个鳕鱼蛾菌落（WA1-WA5）进行了相对于分离物 GV-0001（Cyd-X 的主要活性成分）的易感性，使用 6×10 的区分浓度 ®4 OB/mL.与易感的实验室菌落相比，观察到的结果表明 GV-0001 对鳕鱼蛾菌落 WA3 缺乏疗效。据证实，WA3 是美国第一例对 CpGV 耐药的蛾子。对一系列 CpGV 分离株进行了 WA3 的进一步测试，并观察到对其他分离株缺乏疗效。然而，三种新开发的 CpGV 制剂可以有效地感染耐药菌落 WA3 的幼虫。我们的研究结果表明，迫切需要监测美国的情况，旨在防止具有 CpGV 抗性的更多鳕蛾种群的出现或传播。需要开发使用新型 CpGV 制剂维持鳕鱼蛾控制功效的策略。
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电阻测试; 区分集中; 昆虫; 龟科; 杆状病毒; 饲养; 现场应用 1. 引言 鳕蛾（Cydia pomonella L.）（鳞翅目：Tortricidae）是一种温带昆虫物种，在幼虫阶段，它可以通过内部摄食破坏虱果（苹果和梨），核果（杏，李子）和核桃等。鳕蛾在 200 多年前入侵北美，从此成为苹果，梨和核桃生产中非常严重的害虫[1]。鳕蛾幼虫深入未成熟和成熟苹果的核心，称为“苹果中的蠕虫”，当它在经济阈值下没有得到很好的控制时，会导致直接的产量损失[1，2]。在美国，有两到三代一年一代的鳕鱼蛾[3]。越冬的透射幼虫在早春和新生的飞蛾交配，并在果树开花后立即开始产卵，通常在花瓣秋季，此时第一批幼虫将钻入发育中的果实。在喂食过程中，通过入口孔推出的裂隙（或“刺痛”）成为水果出没的明显迹象[4，5]。幼虫在第五龄时离开果实，在树干树皮下或果园中其他受保护位置化蛹。连续几代人继续以发育中的水果为食，尽管根据收获时间，受感染的水果并不总是容易观察到，并可能导致水果受到污染。尽管化学杀虫剂可以控制鳕鱼蛾，但存在非靶标风险，并且有记录表明对拟除虫菊酯和其他化学品具有耐药性[6，7，8]。此外，消费者对有机水果的需求直接推动了害虫控制策略转向生物方法。例如，使用 Cydia pomonella 肉芽病毒（CpGV）的信息素、脊索虫和商用制剂的交配破坏已被应用于减少有机和常规果园中的鳕鱼蛾种群[9，10，11，12]。
CpGV 是一种双链 DNA 病毒，属于 杆状病毒科的 βbaculovirus 属[13]。CpGV 的闭塞体（OB）平均尺寸为 360×210 nm（长×宽）含有单个病毒粒子[14]。CpGV 对溺爱蛾幼虫具有很强的特异性和高度的毒性。中位致死剂量（LD 50 ）第一龄（L1）为 1.37~28 OB，第五龄（L5）为 10~92 OB[15]，具体取决于实验设置。CpGV 于 20 世纪 70 年代和 80 年代在欧洲和北美开发为生物控制剂，并于 20 世纪 80 年代后期首次注册[16]。病毒 OB 通过溺爱蛾幼虫摄入，导致中肠的初始感染，感染从那里扩散到其他组织。在感染结束时，幼虫体内充满了新产生的 Obs，幼虫变白或呈乳白色。CpGV 感染的鳕鱼蛾幼虫将在感染后 3-7天内死亡，但在某些种群中发生致死延迟，需要长达 14 天的时间才能幼虫死亡。当 CpGV 产品用于控制鳕蛾时，在田间可达到75%-90%的有效率[17]。
CpGV 制剂由于其宿主特异性、高效且环保的特性，已被开发成为世界各地有机和综合病虫害管理（IPM）果园中鳕鱼蛾管理应用最广泛的生物控制产品[9，18，19]。自 CpGV 首次从墨西哥的果园中分离出 CpGV-M [20]以来，已经收集了 40 多种CpGV 分离株并将其分组为 7 个系统发育谱系，即基因组组 A 至 G[20，21]。来自基因组组 A，E 和 B 的分离物，如 CpGV-M，CpGV-S 和 CpGV-E2，已被开发成不同的商业配方（表 表 1）。CpGV 在东方果蛾 Grapholita molesta Busck（鳞翅目：Tortricidae）上进一步分离，选择和传代，对鳕鱼蛾和东方果蛾具有高毒力。
表 表 1.在美国和欧洲的商业和实验性 CpGV 产品/配方。本研究中使用的制剂标有星号*。
在成功应用基于 CpGV-M 的商业产品多年后，发现德国南部和法国的鳕鱼蛾种群对 CpGV 的易感性降低了 1000-100，000 倍[22，23]。这些发现是首次记录的宿主对商业杆状病毒生物防治产品耐药的病例。鳕蛾田间种群对含有 CpGV-M 的产品的抗性被称为 I 型，在其他欧洲国家（如荷兰、瑞士、奥地利、意大利和捷克共和国）也有进一步记录，威胁到当地有机苹果的生产[23，24，25]。同时，广泛的耐药性和遗传学研究显示，对 CpGV 的现场耐药性有 3 种类型（I-III），具有可区分的遗传模式和对属于不同基因组组的 CpGV 分离株的不同易感性[23，26]。除此之外，法国和意大利还发生了新发现的抗药类型[27]。最常见的 I 型耐药性表现为显性遗传性 Z 染色体遗传，高度稳定，可能没有适应成本[23，28]。实验室选择并自然收集的 CpGV分离株可以克服电流电阻类型[23，26，29，30]。
苹果是美国最有价值的果子品种之一，超过 90%的美国有机苹果产自华盛顿州[31]。在这些果园中，CpGV 产品是害虫管理计划的重要组成部分，通常与交配中断相结合。几种 CpGV 产品在北美的 8100-12，200 公顷土地上使用了几十年[9]。目前，Cyd-X，Cyd-X HP，Madex HP 和 ViroSoft CP4 的 CpGV 产品正在美国使用。连续几年每代 CpGV 的频繁应用以及受感染水果的增加导致了美国 CpGV 耐药性的问题。
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华盛顿州的一些有机苹果园注意到，尽管经常使用 CpGV，但鳕鱼蛾感染率很高。我们从华盛顿州的五个果园收集了越冬幼虫，以测试它们对 CpGV 产品的敏感性。我们应用了一种方案，使用鉴别 CpGV 浓度来区分易感和耐药的鳕鱼蛾幼虫[23]。我们进一步旨在确定这些菌落对不同 CpGV 产品和配方的耐药性状态，并使用新开发的 CpGV 产品提供克服 CpGV 耐药性的可能解决方案。
2. 材料和方法 昆虫、病毒
易感实验室菌落（LabS）来自 Benzon Research（美国宾夕法尼亚州卡莱尔）昆虫饲养公司。这个殖民地是 20 多年前在华盛顿州的亚基马农业研究实验室建立的。使用了2018-2019年冬季从华盛顿州东部有机苹果园收集的五个种群（WA1-WA5）作为暂停幼虫。将悬浮幼虫保持在 10°C 的黑暗条件下直至化蛹。成虫和后代幼虫在美国新泽西州布里奇顿的罗格斯大学农业研究和推广中心，在 16/8 小时（光/暗）的光周期下，在 25°C 的气候室中饲养。所有鳕鱼蛾菌落均维持在由玉米粉、小麦胚芽、啤酒酵母、琼脂、抗坏血酸、Nipagin 和苯甲酸的两种防腐剂以及水组成的人工日粮上[32]。
不同商业产品和测试配方的病毒库存（表 表 1）储存在-20°C。
在光学显微镜（尼康 ECLIPSE E600）的暗场下，使用Petroff-Hausser 室（深度 0.02 mm）对 OB 浓度进行计数。
CpGV 制剂对鳕鱼蛾幼虫的活性
对于耐药性测试，将病毒 OB 悬浮在分子级水中至浓度为 3×10 6 OB / mL，一旦冷却至 45°C，将 1 mL 的总体积掺入 49 mL 半人工日粮中[32]，最终浓度为 6×10 4 源自信用证的 OB/mL 95 在实验室生物测定中，易感的鳕鱼蛾菌落对 CpGV-M 的价值[23，28]。在这种所谓的鉴别浓度下，完全易感新生儿幼虫（L1）的死亡率预计在感染后 7 天（dpi）后为>95%，在 14 dpi后高达 100%，而 CpGV 耐药性鳕蛾（CpR）的平均死亡率显著降低[23]。因此，应用这种判别浓度来监测 LabS 和 WA1 的 L1幼虫对 WA5 的易感性。将日粮与 OB 混合后，将 50mL 日粮倒入可高压灭菌的 50 孔托盘（LICEFA，Bad Salzuflen，德国）中，并在室温下干燥 1 天。每个孔的尺寸为 1.5×1.5×1.5 厘米（长×宽×高）。将一只新鲜孵化（0-12 小时龄）的鳕鱼蛾幼虫（L1）转移到每个井中。对于未经处理的对照，将 1mL 分子级水掺入日粮中，执行相同的程序。LabS 菌落和 WA1-WA5 的幼虫都使用相同的方案进行评估。在耐药性测试中评估每个重复的 30 至 50 个幼虫，如果没有其他指示，则评估每个分离株的三个重复。对 7 dpi 下 GV-0001（Cyd-X）死亡率低于 30%的菌落，在鉴别性 OB 浓度下，对其它 7 种 CpGV 分离株/产物进行进一步生物测定（表 表 1）[23]。死亡个体以 1，7，14 和 21 dpi 记录。由于处理而在第 1 天死亡的幼虫被排除在实验之外。如果需要，根据雅培公式，校正 7、14 和 21 dpi 时的平均死亡率，以表示对照死亡率[33]。使用 t 检验和单因子方差分析数据，然后使用
Tukey-Kramer HSD 进行多重比较，以在 JMP PRO 15 中进行显着差异分析。结果在 GraphPad Prism 9.1（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）中绘制。
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3. 结果和讨论 西澳菌落的抗性测试
当 LabS 菌落和 5 个 WA 菌落的幼虫暴露于 GV-0001 时，区分浓度为 6×10 4 OB / mL，LabS（n = 3 重复，N = 146 幼虫），WA1（n = 1，N = 36），WA2（n = 1，N = 29），WA3（n = 3，N = 143），WA4（n = 1，N = 35）和 WA5（n = 2，N = 65）的死亡率分别为 95.4%，100.0%，100.0%，15.9%，41.8%和 100%（图 图 1）。与 GV-0001 在内部参比实验室上的杀幼虫活性相比，菌落 WA3 和 WA4 显示出降低的敏感性。另一方面，WA3 在 14 和 21 dpi 时的死亡率分别为 41.8%和 67.3%，WA4 集落在 14 和 21 dpi 时的死亡率分别为 67.7%和 100%。综上所述，耐药性测试表明，WA3 比其他菌落更不易感，并且被认为对由 CpGV-M（基因组组 A）组成的 GV-0001（Cyd-X）具有部分耐药性（表 表 1）。WA4 也可能对 GV-001 表现出部分耐药性，因为与 LabS 或 WA1，WA2 和 WA5 相比，第 7 天和第 14 天的死亡率也大大降低，后者显示当受到歧视性浓度的挑战时，易感集落的典型死亡率为>95%。然而，养殖幼虫的数量不足以对 WA1，WA2，WA4 和 WA5 进行额外的重复（图 图 1）。仅对LabS和WA3菌落进行统计分析，表明GV-0001诱导的LabS和WA3的死亡率分别在7，14和21 dpi时显着不同（p <0.05）（图 图 1）。
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图 图 1.感染后 7、14 和 21 天 （dpi）
6 个鳕蛾菌落 LabS、WA1 至 WA5 暴露于 6 × 10 的死亡率（平均±标准误差）
4 OB/mL GV-0001 （Cyd-X）.分别表示 7、14 和 21 dpi 死亡率的每个数据点绘制为正方形、三角形和周期。在 p<0.05 处用 t 检验分析数据。不同的大写字母、小写字母和数字分别表示 7、14 和 21 dpi 时死亡率的显著差异。每个鳕蛾群落的重复次数（n）和测试个体总数（N）显示在图表下方。
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根据产品规格，CpGV 产品应每 7-8 个晴天施用一次，在华盛顿州的一些地区，在单个苹果生长季节，这很容易超过 10次喷雾。比较 CpGV 在欧洲的应用历史和目前的结果，华盛顿州出现了 GV-0001 缺乏功效的情况。来自 WA3 菌落的 CpGV 暴露幼虫已成功化蛹并进入成虫（数据未显示），表明对 GV-0001 的抗性可以传递给下一代。使用与 CpGV OB 混合的人工日粮进行实验室耐药性测试可以获得可靠的结果，以识别 CpGV 抗性鳕鱼蛾种群。因此，如果给定的鳕鱼蛾种群对 CpGV 试剂和产品具有抗药性，这是一个很好的指标[34，35]。
CpGV 配方对 WA3 的活性测试
在确定 GV-0001 对 WA3 集落的疗效降低后，我们测试了其他七种含有不同 CpGV 分离株的可用 CpGV 制剂（图 图 1）。所有 CpGV 制剂对 LabS 集落具有高毒力（图 图 S1），而 WA3 集落在 7 dpi（F = 7.64，df = 7，p < 0.05），14 dpi（F = 7.51，df = 7，p < 0.05）和 21 dpi（F = 6.02，df = 7，p < 0.05）（图 图 2）下对 CpGV 制剂的敏感性显着不同。).在 7 dpi 时，GV-0001、GV-0014（Madex HP）和 CpGV-S（Virosoft CP4）引起的死亡率分别显著低于 GV-0015、GV-0013 和 GV-0017 引起的死亡
率（p <0.05）。在 14 dpi 时，GV-0014 和 CpGV-S 引起的死亡率分别显着低于 GV-0015，GV-0013 和 GV-0017 引起的死亡率（p <0.05）。在 21 dpi 时，只有 CpGV-S 诱导的死亡率分别显着低于 GV-0015，GV-0013 和 GV-0017 诱导的死亡率（p <0.05）。WA3 集落对基因组组 A 和 E 的 CpGV 分离株的敏感性较低，但相对于基因组组 B 不具有敏感性。这种易感性模式类似于 II 型或 III 型耐药性[26]。所有新开发的 GV-0015，GV-0013 和 GV-0017 分离株组成或含有属于基因组组 B 的 CpGV 的一部分，在所有测试中似乎比其他 CpGV 制剂对 WA3 幼虫的毒性更大（图 图 2）。这些发现与以往的耐药性检测报告类似，属于基因组 B组的 CpGV 分离株能够克服当前所有类型的耐药性[21，26]。在 21 dpi 之后，幸存的幼虫完成发育成成虫。当成虫是单对杂交时，它们产下了活卵，这些卵用于建立遗传同质的 WA3 群体（数据未显示），表明野生 WA3 群体中存在对 CpGV 抗性的基因反应。在欧洲国家，含有耐药性和易感个体的田间鳕蛾种群具有相似的特征[26，36]。
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图 图 2.来自 WA3 菌落的鳕蛾第一龄的死亡率（平均±标准误差）暴露于 8 种 CpGV 制剂，浓度为 6×10 4 OB/mL.在感染后 7、14 和 21 天 （dpi）
记录的死亡率。分别将表示 7、14 和 21 dpi 死亡率的每个数据点绘制为正方形、三角形和周期。用单因子方差分析数据，然后在 p <0.05 下进行 Tukey-Kramer HSD 比较。不同的大写字母、小写字母和数字分别表示 7、14 和 21 dpi 时死亡率的显著差异。所有测试个体（N）和重复（n）显示在图表下方。
在这里，我们首次在美国记录了鳕鱼蛾在美国华盛顿州对 CpGV-M（= GV-0001）的抗性，这表明建立 CpGV 抗性的遗传背景不仅限于欧洲的鳕鱼蛾种群。为了进一步研究在 WA3 菌落中观察到的抗性，需要进一步研究抗性的机制和遗传。作为第一步，近交和进一步选择对于建立遗传同质系是必要的。然后需要进行单对交叉实验和抗性测试，以确定遗传模式，并评估 WA3的 CpGV 电阻是否确实与 II 型或 III 型电阻相似[23，26]。从我们的检测中可以得出结论，由于对属于基因组组 A 或 E（GV-0001，GV-0003，GV-0014，GV-0006 和 CpGV-S）的 CpGV 变异缺乏敏感性，因此它不遵循 I 型耐药性的耐药模式[23，26]。从欧洲 CpGV 耐药性的经验...
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