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磁性纳米团簇提高侧流免疫分析对蛋白质检测的敏感性:气门溶解素作为 肺炎链球菌 生物标志物的应用
抽象
用于检测体液中生物标志物的侧流免疫测定是简单、快速、廉价的床旁检测,广泛用于疾病监测,例如在 2019 年冠状病毒病(COVID-19)大流行期间。敏感性的提高将增加它们在医疗保健,食品安全和环境控制方面的效用。最近,生物官能磁性纳米团簇已被用于选择性标记靶蛋白,这允许它们使用磁电感传感器进行检测和定量。这种类型的检测器很容易与侧流免疫测定形式集成。肺溶血素是一种胆固醇依赖性细胞溶解素,是肺炎 链球菌 产生的肺炎最重要的蛋白质毒力因子之一。它被认为是尿液样本诊断的重要生物标志物。肺炎是全球死亡人数最多的传染病,特别是在五岁以下儿童和 65 岁以上的成年人中,其中大多数发生在低收入和中等收入国家。特别是在那里,具有高敏感性和特异性的肺炎球菌性肺炎的快速诊断性尿液检测将有助于初级保健。在这项工作中,将磁性纳米团簇偶联为抗气门溶蛋白抗体的侧流免疫测定与两种策略相结合,以提高该技术的性能。首先,免疫测定前蛋白质的磁性浓度随后通过移动电话摄像机进行定量,电感式传感器每毫升的气溶素检测限低至 0.57ng(电话摄像头)和 0.24ng(电感式传感器)。其次,免疫测定完成后,试纸条内颗粒的磁性重新定位使检测到的信号增加了 20%。与非便携式常规气门溶血素检测技术(如酶联免疫吸附测定)相比,便携式设备获得的这种结果是有希望的。这些方法的组合和优化将在床旁生物检测中有很好的应用,以减少抗生素滥用,住院治疗和社区获得性肺炎的死亡。
关键字:
侧流免疫测定; 肺炎球菌性肺炎;2019 冠状病毒病; 磁性纳米颗粒; 磁选; 电感式传感器 1. 引言
肺炎是全球传染病死亡的主要原因[1]。此外,其高发病率使其与其他下呼吸道疾病一起成为全球第三大死亡原因,仅次于缺血性心脏和脑血管疾病[2]。肺炎发病率在极端年龄最为显著。高危人群是老年人(>65 岁),尤其是有合并症的老年人和儿童(<5 岁),对他们来说,这是新生儿期后死亡的主要原因。这尤其令人担忧,因为大多数肺炎死亡应该是可以预防的[3]。即使不是致命的,也会在发病后较长时间内增加死亡风险[4]。不断增长的老龄化和合并症的增加[5]使这一前景更加糟糕,对全球医疗保健系统产生了相当大的影响[6]。
肺炎病原体的鉴定对于指导治疗(避免抗生素过度处方)以及预防和控制策略至关重要;细菌、病毒和真菌均可引起肺炎[7]。肺炎链球菌(肺炎 球菌)仍然是大多数社区获得性肺炎和其他呼吸道和全身感染(如脑膜炎)的主要病原体[8]。肺炎是目前COVID-19 患者中最常见的合并感染,可能对发病率和死亡率有显著影响[9,10]。
通常,肺炎球菌性肺炎的诊断基于革兰氏染色和痰液或血培养。不幸的是,前者的适当样本很难获得,特别是从儿科患者中,后者的产量出奇地差[11]。聚合酶链反应(PCR)技术可用于检测细菌[12],检测限低至 10 3 每毫升基因组拷贝数[13]。然而,它需要复杂的设备和 DNA 试剂盒,这些设备和 DNA 试剂盒对于全球的初级医疗中心和资源贫乏的地方来说可能是负担不起的。另一种选择是商业侧流测试 Binax Now,用于检测尿液中的肺炎球菌多糖 C。然而,据报道,该药在成人中的敏感性较低,可能与血清型改变及其多糖 C 变异性有关[14],如果儿童既往患有支气管肺疾病或接种过疫苗,则无帮助[15,16]。因此,目前在肺炎诊断方面的挑战,主要但不仅限于儿童,是在方便的样本(如尿液)中具有高敏感性和特异性的快速诊断测试。单独或与其他方法结合使用,它将能够实现精确的诊断和及时的治疗,减少住院治疗,避免经验性抗生素处方和增加抗生素耐药性,特别是在欠发达国家,预防致命的结果。
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肺溶解素(PLY)是一种 53 kDa 的蛋白质,也是肺炎球菌研究最多的毒力因子之一,在蛋白质水平上是最重要的。PLY是一种蛋白质毒素,属于硫醇活化毒素家族,也称为胆固醇依赖性细胞溶解素。它由 20 多种革兰氏阳性细菌产生,其特征在于通过与胆固醇结合在真核细胞膜中形成孔隙,导致细胞破坏[17,18]。PLY 保守序列在几乎所有肺炎球菌分离株中均有表达。它在肺炎球菌致病性中的作用已被广泛研究;缺乏 PLY 表达的突变细菌证明其在感染中的相关功能[19,20]。这导致一些作者通
过使用直接或间接阻断其作用机制的分子来研究其作为肺炎球菌感染治疗靶点的潜在作用[21]。PLY 作为诊断靶点的作用鲜为人知。我们以前的研究已经证明了其作为肺炎球菌感染的潜在生物学标志物的重要性,因为它的检测是该疾病的症状[22]。因此,已经开发了用于病患者尿液中 PLY 检测的不同酶联免疫吸附测定(ELISA)检测[23,24],化学发光测定的最低检测限为 2.3 pg/mL。然而,这些测试需要特殊且昂贵的试剂和设备,因此很难在资源贫乏的地方建立它们。
侧流免疫测定 (LFA)
是生物测试方法,具有许多优点,适用于床旁 (POC)
应用,例如最少的操作、快速性、便携性、易用性和低成本。它们在 20 世纪 80 年代初通过家庭妊娠试验[25]进入一般市场,COVID-19 大流行使他们更加熟悉。除了这些应用外,它们还已成功用于检测不同类型标本中的其他靶标[26,27]。
LFA 取决于毛细血管作用和生物识别。硝化纤维素条通过毛细管引导液体样品,目标分子通过免疫反应选择性地捕获在测试线上。生物分子用纳米颗粒标记,使其可检测。这些纳米颗粒(金或乳胶)发出颜色信号,提供是/否(存在/不存在)响应。这样的定性结果对于许多应用来说已经足够了。然而,许多其他人需要定量结果来诊断和预后,血清学信息或与毒素阈值的比较。分析物的定量可以通过基于图像分析或反射率的光学换能器来完成。据我们所知,只有一种采用等离子体表面增强共振拉曼散射(SERSS)的 LFA 已经发表[28],检测限为 3.6 pg / mL。然而,SERSS 的信号量化系统很难用于便携式和分散式检测设备。此外,光学方法对环境光、湿度以及纸条染色或老化的干扰敏感,这经常导致校准和再现性方面的困难[27,29]。此外,只有膜表面的纳米颗粒对信号有显著贡献[30]。
磁性纳米颗粒以前曾被用作 LFA 中的有效标记[31]。它们可以很容易地根据尺寸、表面和磁性进行定制。磁性传感器可以在没有生物样品或纸张干扰的情况下检测它们。更有趣的是,这些磁性可用于外部操作,预浓缩或从样品基质中分离目标分析物。这些策略可以极大地提高 LFA 的敏感性[32,33]。
我们的研究小组开发了一种使用超顺磁性纳米颗粒和电感式传感器的检测方法,该方法不会影响 LFA 的优势。它基于激励检测平面线圈,无需额外的激励线圈或笨重的组件[34,35]。它是一种经济实惠的系统,可以在 POC 设备中轻松小型化。先前的研究表明,磁性标签的关键特性是其初始磁化率和测试线中保留的质量[36]。从这个角度来看,磁性纳米颗粒簇比孤立的颗粒更有利。
对于这项工作,我们开发了一种 LFA 来检测与抗 PLY 抗体偶联的生物功能磁性纳米团簇(MNCs)。多元醇溶剂热合成方法针对可重复和可扩展的生产进行了优化,产生了具有大初始磁化率和高磁矩的 MNC。由于跨国公司的多功能性,LFA 的灵敏度得到了相当大的提高。首先,磁预浓缩和重定位降低了检测限。其次,MNC 可实现双重检测:光学(测试线具有褐色)和磁性(例如,使用电感式传感器可检测)。
2. 材料和方法
化学品、试剂
聚丙烯酸钠(分子量≈2100),氯化铁 3 ·6H 2 O,抗小鼠 IgG(M8642-1MG),1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),牛血清白蛋白(BSA),2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)和吐温 20 是从 Sigma-Aldrich(西班牙马德里)购买的。Neutravidin 蛋白来自 Thermo Fischer Scientific(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。二甘醇 99%和乙二醇 99%分别来自 Alfa Aesar(德国 Kandel)和 S.C. Simex SRL(罗马尼亚盖尔拉)。乙醇纯度从化学公司(罗马尼亚雅西)获得,首先,含有 NaH 的 10 mM 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
2 采购订单 4 (0.065 g)
和 Na 2 人道 4 使用超纯水制备(0.2875 g),并通过加入 HCl(1 M)或 NaOH(1 M)将其 pH 调节至 7.4。使用超纯水制备进一步的稀释液。
按照[37]中描述的程序生产重组气毒素蛋白。将 层 状基因克隆到 pTrc 99A 质粒中,并将蛋白质在 大肠杆菌 JM105 中表达。通过使用 HiLoad 16/10 苯基 - 琼脂糖疏水柱从细胞裂解物中纯化毒素。抗气门溶素单克隆抗体(PLY-4 用作捕获抗体,PLY-7用作检测抗体)由奥维耶多大学科学技术服务部门提供,并按照先前的描述生产[38]。简而言之,BALB / c 小鼠在 200mL 完全弗氏佐剂中用 10mg 毒素进行连续几轮免疫。通过标准方法将来自免疫动物的脾细胞以 1:1 的比例融合到 Sp2 / 0 细胞中,并且选择的杂交瘤被亚克隆两次。在蛋白 A 快速流动柱上通过亲和色谱纯化上清液中的 IgG,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶联免疫吸附测定法评估其纯度和反应性。
对于横向流带,背衬卡(HF000MC100)和用作样品垫的玻璃纤维膜(GFCP001000)是从默克生命科学(西班牙马德里)购买的。硝化纤维素膜(UniSart CN95)由西班牙马德里的 Sartorius 提供,吸收垫(CF5)由 Cytiva Europe GmbH(西班牙马德里)提供。所有这些组件都未经进一步修改(既不清洗也不堵塞)使用。
磁性奈米团簇的合成与表征
MNC 合成是通过类似于[39]的溶剂热多元醇工艺进行的,但有一些变化。使用乙二醇(20 mL)和二甘醇(40 mL)的混合物来悬浮/溶解乙酸钠(6g)和聚丙烯酸钠(6g)。氯化铁 3 ·6H 2 O(2.17 克)溶于二甘醇(20 毫升)。在室温下搅拌 10分钟后,将氯化铁溶液加入醋酸盐和聚丙烯酸酯的悬浮液/溶液中,再搅拌 10 分钟,并转移到特氟龙衬里高压釜(200mL 容量)中。将高压釜加热至 200°C15.5 小时并自然冷却。将磁铁矿团簇用乙醇冲洗到烧杯中,磁力分离,并用乙醇洗涤两次,用水洗涤三次,然后重新悬浮在水中。磁簇浓度为 22 mg/g 悬浮液。
采用扫描透射电子显微镜(STEM)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)对纳米团簇的尺寸和形状进行了检测.STEM图像是用 Hitachi HD2700(日立有限公司,日本东京)获得的,该设备配备了冷场发射枪和牛津仪器的双能量色散 X 射线系统(X-Max N100TLE 硅漂移探测器)。对于分析,先前用 UP100H 超声手指超声处理样品的悬浮液(<10 s),并通过液滴法沉积在涂有薄碳层的 400 目铜网格上。额定工作电压为 200 kV。HRTEM 图像是用 JEOL JEM-2100 200 kV(JEOL USA Inc.,Peabody,MA,USA)获得的。
采用傅里叶变换红外(FT-IR)和 X 射线光电子(XPS)光谱对团簇表面化学组成进行了分析。使用带有 ATR-PRO-ONE附件的 JASCO FTIR 4600A 分光光度计(JASCO Deutschland GmbH,德国 Pfungstadt)记录 FT-IR 光谱。频谱是一氧化碳2 -, H 2 O-、ATR-和基线校正。使用 SPECS XPS 光谱仪(SPECS Surface Nano Analysis GmbH,德国柏林)获得 XPS 光谱,该仪器配备了双阳极Al / Mg X射线源,PHOIBOS 150 2D CCD半球能量分析仪和真空保持在1.3×10的多通道探测器 −10千帕。Al Kα X 射线源(1486.6 eV)在 200 W 下工作,用于 XPS 调查。XPS 测量光谱记录在 30 eV 通过能量,0.5 eV /步。通过在 30 eV 通过能量和每步 0.1 eV 的温度下累积多次扫描来记录单个元素的高分辨率光谱。
使用振动样品磁力计进行直流磁化测量(Cryogenic Ltd.,英国伦敦)。零场冷却(ZFC)和场冷却(FC)曲线是使用量子设计 SQUID 磁力计获得的(量子设计,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。零场冷却( )
和现场冷却 ( )通过在零磁场中将样品从室温冷却到 5 K 来进行磁化测量;然后,施加 2.5 mT 的静态磁场。
在 5 至 300 K 的变暖过程中测量,而 在随后的冷却过程中记录。磁化值参考了通过热重分析测量的氧化铁的质量。
通过将一些已知质量的液滴沉积在 10 mm×2 mm 的印迹纸上并干燥至少 12 小时,对 MNC 作为电感式传感器中报告者的评估。自制电感式传感器经过专门调整,用于扫描样品(见图 图 1)。传感器的详细说明可以在别处找到[40,41]。它由一个平面电感器组成,其阻抗幅度和相位通过精密阻抗分析仪(Agilent 4294A,16048G 测试引线,500 mV/20 MHz,是德科技,加利福尼亚州圣罗莎,美国)连续测量,同时样品以 0.1 mm 的步长进行微定位和位移。平面线圈被构造为印刷电路板(PCB),由商业上可用的工业过程生产。PCB 的基板是 FR-4 标准 Tg 130-140 / Tg 155,尺寸为 1.6 mm。敏感区域的轨道由 0.018 毫米厚的铜层制成,通过化学工艺沉积,并由氯化铜蚀刻。轨道的周围区域充满了光活化的环氧树脂,使表面变平。平面线圈的具体尺寸是轨道宽度为 0.15 mm 的两圈平面电感器和 0.15 mm 的轨道间隔。敏感区域完全由平行轨道组成,尺寸为 1.4 毫米×12毫米。这些尺寸在垂直方向上覆盖样品,但不沿着纵向方向覆盖样品。样品扫描覆盖了该纵向尺寸。
定位系统在扫描过程中使样品和传感器表面保持密切接触。两者之间的压力为 0.9 N,忽略样品重量。颗粒的高磁导率在扫描过程中导致阻抗增加。该峰在位置上积分,以考虑样品中存在的所有颗粒,无论它们如何分布。然后,通过传感器灵敏度( ),定义为磁阻抗传感器。对于固定频率和类型的颗粒, 定义为每单位质量粒子( ).为 与 和 电感式传感器中没有颗粒:
(1) 传感器的分辨率( )
定义为要解决的最小质量变化,其中 是测量空白时作为信号随时间变化的标准偏差的噪声,以及 是 : (2) 2.3. 磁簇的生物共轭
为了评估跨国公司在 LFA 中的表现,它们首先与纽曲维京偶联,并用固定生物素测试线用于 LFA 条。对于这种键合,我们使用存在于 MNC 表面的羧基通过碳二亚胺化学连接新曲维红素。为此,将 10μL 颗粒(先前超声...