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入侵 性 Lycorma delicatula 的第一批幼虫的多样化宿主植自 物：来自 eDNA Metabarcoding 的见解
抽象 识别入侵斑点灯笼蝇 Lycorma delicatula（半翅目：Fulgoridae）的寄主植物一直是许多研究的重点。虽然成虫和晚若虫相对容易在植物上观察并用于分子肠道内容物分析，但研究早期幼虫更具挑战性。这项研究是我们正在进行的努力的延续，以确定 L. delicatula 的每个发育阶段的宿主范围。在本研究中，我们只关注第一批若虫幼虫，并使用一种新颖的方法，利用“大量”DNA 提取物对若虫肠道内容物进行 DNA 元条形码，以鉴定若虫在收集之前摄入的所有可检测植物。我们能够获得部分 红细胞 L 基因的高质量扩增子（高达 406 bp），并检测到属于 17 科的 27 种独特摄取植物物种。本地和引进植物都有树木和草的流行，存在于摄入的植物中。我们还确定了 13 种新的寄主植物，这些植物以前没有在美国领土上报道过 L. delicatula。我们的研究结果对于开发早期 监测侵入 性乳杆菌的有效计划具有重要的应用。
关键字：
eDNA 偏条形码; 主机- 植物用法; 昆虫肠道内容物; 入侵物种; 斑点灯笼蝇; 营养相互作用 1. 引言 斑点灯笼蝇 （半 翅目：Fulgoridae）是北美一种高度侵入性的以树液为食的昆虫，也是美国中大西洋地区最具侵略性的害虫之一[1，2，3，4，5，6，7]。自 2014 年在宾夕法尼亚州伯克斯县首次发现来自亚洲以来，L. delicatula 迅速分散并在邻近州及其他地区建立了种群。对美国领土的 入侵 仍在继续：迄今为止，已在 15 个州发现了 L. delicatula 个体;其中，9 个州有严重的侵扰，4 个州有多个内部隔离区[8]。
L. delicatula 的寄主植物范围一直是许多研究的焦点，因为它是高度多食性的，目前的宿主列表涵盖了大量不同分类水平，生命形式，形态和植物结构的寄主植物，以及共同进化（即起源于亚洲）和非进化宿主（即起源于亚洲以外的其他地区， 无论是土生土长的还是引入美国的），包括各种森林树木（天堂树，桦树，枫树，核桃，橡树等），果树（如苹果树和葡萄），以及许多观赏植物[4，7，9，10，11]。由于高度多食性，L. delicatula 对林业和农业构成重大风险;成虫和 4 龄若虫以宿主韧皮部组织为食，造成植物损伤，包括植物光合作用减少、流泪伤口，并为最终影响植物生长并降低果实品质的烟尘霉菌创造条件[1，3，5，6，12]。
管理，特别是对 L. delicatula 的早期监测具有挑战性，特别是由于其在昆虫发育过程中不寻常地使用植物宿主;随着若虫的成熟，它们的寄主植物范围减少，当昆虫达到成虫阶段时，它们有一个或两个首选的宿主植物[1]。迄今为止，正在进行多项工作来破译成年期和若虫期的寄主植物范围 ， 并成功尝试准确确认成虫和晚若虫幼虫消耗的宿主植物[9]。然而，早期的若虫龄，尤其是第一龄，在实验研究中受到的关注较少。由于它们体积小，颜色隐晦，并且谨慎的汁液摄食行为，第一批幼虫很难找到和监测。虽然大多数关于 乳杆菌 喂养偏好的研究仍然集中在实验观察结果上[5，13]，但最近使用基于 PCR 的 DNA 分析的进展为快速可靠地检测和鉴定 乳 杆菌的饮食提供了机会[6，14]。在我们之前关于从 L. delicatula 的肠道内容物中检测植物 DNA 的工作中[6]，我们只关注晚若虫龄（第三和第四若虫龄）。使用 Sanger 测序来检测灯笼蝇肠道内容物中最丰富的植物项目，我们发现（a）摄入的约 93%若虫中的植物与收集若虫的植物不符（可能是由于若虫的高流动性），并且（b）共同进化（即引入美国）和非共进化（即， 原产于美国）植物，以及木本植物和非木本植物被摄入。此外，为了优化我们的 DNA 工作，我们对已发表的 PCR 方法进行了系统综述，以检测害虫摄入的寄主植物[15]。
特别是昆虫肠道内容物的 DNA 元条形码已被证明是一种有效的方法，使我们能够准确地确定昆虫害虫的宿主 - 植物范围[16]，重建害虫的入侵路线[17]，害虫迁徙[18，19，20]，以及记录已实现的和新颖的植物 - 昆虫关联[21，22，23].一般而言，与观察或基于形态学的昆虫饮食分析方法相比，DNA 超条形码的优势在于检测摄入的植物多样性和组成[24]。DNA 偏条形码方法在不同群落中物种的生物监测中具有重要的应用[25]，并且特别适用于恢复监测[24]。此外，最近在环境 DNA（eDNA）条形
码（即使用特定 DNA 片段同时鉴定一个环境样本中多个分类群的物种）方面的实践表明，与单个生物体的 DNA 条形码相比，使用环境块 DNA 提取物具有优势[26，27，28]].在这项研究中，在这项研究中，我们首次从 L. delicatula 的多个若虫个体中“批量”提取 DNA。我们预计这种方法（a）将有利于提高每个批量样品的 DNA 产量（与“单一昆虫”方法相比）;（b）
具有时间和成本效益;最重要的是，（c）将导致不同的肠道内容样本，这反过来又将准确地代表摄入的植物物种的多样性，这是我们研究的主要焦点。最后，根据 Van Der Heyde 等人的建议应用[24]，我们旨在展示 L. delicatula 肠道内容物的 DNA 元条形码在早期监测第一个若虫幼虫中的效用，对此有日益增长的需求。这种 DNA 元条形码方法对于有效监测 L. delicatula 种群在其寄主植物上的运动以及早期检测新型宿主植物和潜在的宿主切换是必要的。
为了实现这些目标，本研究的主要重点是证明 eDNA 元条形码在确定入侵性斑点灯笼蝇 L. delicatula 的第一个若虫龄的宿主 - 植物范围的效用。此外，我们还在木性和多年生性方面探索摄入植物的多样性，以及共同进化/非进化寄主植物的比例。我们还期望检测到以前未被记录为 L. delicatula 宿主植物的摄入植物物种。基于这些发现，我们讨论了早期若虫幼虫潜在寄主植物及其有效监测的重要意义。由于我们只关注摄入的植物，类似于我们之前对害虫饮食分析的研究[6，29]，并且仅出于本研究的目的，我们将继续使用术语“宿主植物”来表示仅食用昆虫食用植物，即 L. delicatula 若虫用作合适食物来源的植物， 而不是特别适合作为繁殖和发育的来源。
2. 材料和方法 2.1. 学习场所
这些植物和第一批若虫幼虫于 2021 年 5 月在塞西尔县（美国马里兰州）进行了两次收集旅行，相隔一周。收藏幡站 （30 × 73 m 2 ）是一个与草地相邻的森林地区，位于费尔希尔州立自然资源管理区（FH-NRMA）（39°42′36.3′′ N，75°51′02.98′′W，马里兰州埃尔克顿）（图 图 1a）。在两个收集日，该地点的天气条件从无云到部分覆盖，温度在 26-29°C 之间，风平静到轻。选择该地点是由于（a）该地区已知的 L. delicatula 种群;（b）
在树干上观察到的大量卵块;（c）其高度的植物多样性（特别是在木本植物中）。FH-NRMA 位于马里兰州东北部的 Fair Hill，坐落在一个 12 公顷的森林地区。以前的研究表明，该地区包含树木密度高（每公顷 225 棵树），树冠高度相对较高（平均 27.8 米）的地点，并且以 Fagus grandifolia（美洲山毛榉），Liriodendron tulipifera（黄杨），Acer rubrum（红枫），Betula lenta（甜桦）和 Quercus alba（白橡树）为主[30]，所有这些都被报道为 L. delicatula 的首选或合适的寄主植物。
[9].
图 图 1.收集地点位于费尔希尔州立自然资源管理区（39°42′36.3′′ N，75°51′02.98′′W，马里兰州埃尔克顿，美国）（a），以及从各种植物（b-d）中观察到和收集的 Lycorma delicatula 的第一个若虫幼虫（b-d）（照片由 Alireza Shokoohi 拍摄）。
2.2. 样本收集和处理
在这项研究中，从草地和森林区域之间的边缘植物中共收集了 37 个 L. delicatula 的第一若虫龄和 28 个参考植物（即，在收集地点生长的每个独特植物的一个剪切部分和一个叶子样本）（图 图 1b-d）。这也是观察到若虫的唯一位置。所有的若虫都是在朝南的木本植物上观察到的。植物样本仅从收集地点（而不是从整个 Fair Hill 州立自然资源管理区）收集，即从观察和收集若虫的地点收集。在收集的 28 个植物样本中，仅从四种植物中观察到并收集了 L. delicatula 若虫：Rosa sp.，Rubus phoenicolasius，Ailanthus altissima 和 Celastrus orbiculatus（表 表 1;样本 p001，p002，p005 和 p007）。从收集的植物中提取的 DNA 的序列分析显示 19 种独特的植物物种。收集后，若虫和叶子样品立即在现场干燥冷冻，并运送到我们在马里兰大学的实验室，在那里它们一直储存在-20°C 直至 DNA 提取。剪切的植物样品用于创建植物标本样品，以在必要时帮助形态学植物识别。
表 表 1.在费尔希尔州立自然资源管理区（美国马里兰州埃尔克顿）的野外地点收集的参考植物物种。收集了观察 Lycorma delicatula若虫的植物和没有侵扰的植物。
DNA 提取， PCR 扩增，纯化
在这项研究中，我们利用我们先前开发的方法从 L. delicatula [6]，马铃薯叶蝉 Empoasca fabae [29]和早期 Melanoplus蚱蜢的肠道内容物中鉴定摄入的植物[31，32]。将 L. delicatula 若虫的整个身体和叶子样品中 5-10 毫米大小的植物组织切口用于 DNA 提取。为了制备大量样品，将一次 6 至 10 个若虫（取决于昆虫大小）放入 1.5 mL 微量离心管（Fisher Scientific Co.，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）中，并使用无 RNase 的一次性颗粒杵研磨其身体（Fisher Scientific Co.，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）。然后将所得组织混合物均匀地分离到其他 1.5 mL 微量离心管中，每个管约 100 mL，以满足制造商的 DNA 提取方案。根据制造商的协议，使用 DNeasy 血液和组织试剂盒（目录号 69506，Qiagen Inc.，马里兰州日耳曼敦，美国）提取 L. delicatula若虫本体样品的基因组 DNA。分离 DNA 后，将样品储存在−4°C 直至 PCR 扩增。此外，还提取了来自一个个体第一若虫龄的DNA;这被用作参考样本。
在样品处理的下一步中，使用来自单个样品和本体样品的基因组 DNA 提取物来检测叶绿体 DNA 编码区的一部分（~530 bp），rbcL 基因（核糖-1，5-二磷酸羧化酶 - 加氧酶）。引物 rbcLaF 和 rbcLaR（从美国加利福尼亚州圣地亚哥的 Integrated DNA Technologies，Inc.购买）用于扩增靶向 DNA 区域。PCR 按照 Avanesyan 和 Lamp [6]中描述的方案使用表 表 2 中指示的 PCR 组分和条件运行。然后使用 Exo-SAP-IT 纯化 PCR 产物（目录号。78201.1.ML，Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，USA），根据制造商的协议。叶样品按照 Avanesyan 等人[29]进行处理;从每个 DNA 提取物中扩增红 细胞 L 基因的相同部分并纯化，然后进行 Sanger 测序，该测序在 Azenta / GENEWIZ（Azenta US，Inc.，South Plainfield，NJ，USA）进行。
表 表 2.在这项研究中，用于扩增部分 红细胞 L 基因的 PCR 成分和条件。
2.4. 序列分析
将含有扩增植物区域的昆虫样品中制备的 PCR产物用于测序。下一代测序（“扩增子-EZ”服务），随后在 Azenta / GENEWIZ（Azenta US，Inc.，South Plainfield，NJ，USA）进行独特的序列丰度分析。扩增子-EZ 服务提供异质 PCR 产物的测序和分析。该服务可处理高达 500 bp 的扩增子，每个样品可产生 50，000 多次读取。选择这项服务是因为（a）完全覆盖了用于 DNA条形码的 rbcL 基因部分的扩增子;（b）检测出的独特序列的交互式分析报告，可以方便地用于后续的物种鉴定。在 Azenta 使用内部脚本对获得的原始读取进行修剪并生成合并的 fasta 文件;然后使用正向和反向引物（如上所述）为这些引物对嵌套的任何 DNA 区域生成最终的唯一共识序列。使用 Galaxy 平台中的 FastQC 工具对每个批量样品的原始读数进行序列质量分析[33]。
昆虫样本（即摄入的植物）和植物样本（即参考植物）的植物物种身份是使用国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库中的 BLAST 引擎确定的然后在所有 L. delicatula 若虫的批量样品中测定独特的摄入植物物种。对于叶样品，从 Azenta获得一个正向序列和一个反向序列;然后使用 4Peaks v. 1.7 修剪序列，并使用 Unipro UGENE 平台对齐。然后使用每个共识序列使用 NCBI GenBank 数据库 BLAST（也于 2021 年 11 月 7 日至 2022 年 4 月 3 日访问）确定植物身份。
从 L. delicatula 若虫的肠道内容物中获得的序列读数按序列长度排序，并且所有长度超过 100 bp 的序列用于植物鉴定。其中，在匹配中显示>90%的序列用于进一步分析。该序列长度是根据我们对序列同一性的初步工作选择的，在此期间，短于100 bp 的序列在与 NCBI GenBank 数据库中沉积的序列匹配时显示出低百分比的同一性（50-70%）。使用美国农业部植物数据库（确定与北美相关的植物起源，特别是美国东部（本地与引进）以及所有已识别摄入的植物物种的植物生命形式。
测量和统计分析
首先使用计数和比例合成了所获得的关于 乳 杆菌若虫肠道内容物中存在各种摄入植物物种的数据。对于参考样本和每个批量样本，首先编制了具有相应序列的唯一识别摄入植物的列表（请参阅 补充材料）。接下来，构建了所有样品中唯一摄入的植物的组合列表，并计算了各种植物家族的比例，以及具有不同起源和生命形式的植物。此外，对于批量样品，确定了每种独特植物物种的比例。使用精确的二项式检验分析了不同来源，家族以及各种生命形式的植物物种的流行情况。为了本研究的目的，用于二项式检验的原假设是植物的类型（即木本与非木本等）以相等的比例表示在 L. delicatula 若虫的肠道内容物中。
每组正向和反向序列读取的平均质量分数是使用Galaxy平台中的FastQC工具检索的;数据分析中仅包括长度超过100 bp（对于大样本）和 150 bp（对于参考样品）的序列的评分。然后使用单因子方差分析与事后 TukeyHSD 在所有样品之间比较平均质量评分。夏皮罗-威尔克和巴特利特检验分别用于研究数据的正态性和异方差性。数据分析，然后创建饼图和箱线图，在 R v.4.1.0 中进行[34]。
3. 结果 3.1. 基本序列统计
平均而言，从每个大样本（样本 1n1-1n10）中检索到 170，078±968...
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